کاربرد بیوتکنولوژی در آبزی پروری: انجماد اسپرم ماهی(1)
سيد مرتضي ابراهيم زاده
مقدمه
انجماد بلند مدت تكنيكي است كه بواسطه ي آن مي توان سلول هاي زنده ، بافت ها ، اندام ها ، رويان، لارو و ... را در دماي خيلي پايين (معمولا در 196- در جه سانتيگراد ) براي يك دوره ي زماني نامشخص ، نگهداري نمود. از اين تكنيك براي نگهداري و ايجاد بانك اسپرم به منظور تكثير مصنوعي در حيوانات پرورشي استفاده شده است. در بين ماهيان نيز كارهاي پژوهشي بسيار زيادي براي انجماد اسپرم و تخمك انجام پذيرفته است.تا به امروز اسپرم قريب به 200گونه ي ماهي به روش نگهداري در سرما، مورد سنجش قرار گرفته است .در شرايط دمايي صفر درجه سانتيگراد ، اسپرم را مي توان از چند ساعت تا چند روز ، بسته به نوع گونه ي مورد آزمايش ، نگهداري نمود. با توجه به يافته هاي تئوريك ، با استفاده از تكنيك نگهداري در سرما، سلول هاي جنسي را مي توان از 200 تا 32000 سال ، بدون كاهش در كيفيت آنها نگهداري نمود ( suquet و همكاران، 2000) .با وجود انجماد اسپرم در بين گونه هاي مختلف ماهي ، تا به امروز در انجماد تجاري تخم ماهي هنوز موفقيت چنداني حاصل نشده است. اندازه ي بزرگ، ساختار پيچيده، وجود چندين غشاء با نفوذپذيري متفاوت از موانع اصلي در انجماد تخم ماهيان مي باشد(Thomas،2003).
مزایای انجماد اسپرم ماهی
1- هم زمان سازي قابليت دسترسي به هر دو جنس
براي تكثير دو نژاد بهاره يا پاييزه يك ماهي كه امكان دسترسي به هر دو جنس در يك زمان وجود ندارد، مي توان از اين روش بهره برد (Blaxter،1953).
2- استفاده از كل حجم مني موجود
براي گونه هايي كه بدست آوردن اسپرم از آنها مشكل مي باشد، مي توان از اين تكنيك استفاده كرد(مانند مارماهي ژاپني )(Ohta و Izawa،1996).همچنين براي استحصال اسپرم از گونه هايي كه در شرايط اسارت اسپرم كافي توليد نمي كنند نيز مي توان از اين روش بهره برد(مانند فلاندر دم زرد)(Clearwter و Crim، 1995).
3- آسان نمودن نگهداري مولدين
القاء تخم ريزي خارج از فصل توليدمثل در بسياري از گونه هاي ماهي پرورشي از طريق دستكاري دوره ي نوري و دمايي قابل اجراست(Bromage، 1995) ولي اين كار پر هزينه خواهد بود(Suquet و همكاران، 2000).زمانيكه اسپرم هاي منجمد شده در تمام سال وجود داشته باشد، دستكاري فصل تكثير تنها به ماهيهاي مولد ماده محدود مي گردد.
4- حمل ونقل آسان سلول هاي جنسي
در زماني كه سلول هاي جنسي مولدين را در محل هاي مختلف جمع آوري مي كنند، با اين روش جا به جايي آنها راحت تر انجام مي گيرد.علاوه بر اين از اين روش براي معرفي ژن هاي مختلف از محيط طبيعي به ذخاير پرورشي نيز مي توان استفاده كرد.
1- جلوگيري از كاهش كيفيت اسپرم
كاهش كيفيت اسپرم در طول فصل توليدمثل در بسياري از گونه هاي ماهي گزارش شده است(Rana،1995). تكنيك انجماد اسپرم امكان جمع آوري اسپرم در زماني كه بالاترين كيفيت را دارا هستند،را فراهم مي كند.
6- حفاظت از تغييرپذيري ژنتيكي جمعيت هاي بومي
استفاده از تعداد محدودي از مولدين در كارگاه هاي تكثير، كاهش هتروزيگوسيتي را در پي خواهد داشت. اسپرم هاي منجمد شده از نژادهاي بهگزيني شده را مي توان به ذخايرگونه هاي پرورشي معرفي نمود.همچنين از بانك ژني موجود در اسپرم هاي منجمد شده مي توان براي حفظ تنوع ژنتيكي جمعيت ماهيهاي در معرض خطر و جلوگيري از آميزش خويشاوندي استفاده كرد.
علاوه بر موارد ذكر شده، در ماهيهاي هرمافروديت پروتوژينوس(مانند هامور)، امكان بدست آوردن اسپرم تنها در سنين 5 تا 10 سالگي وجود دارد از اين رو براي تكثير مصنوعي اين ماهيان داشتن ذخاير اسپرمي بسيار مفيد و حتي ضروري مي باشد(Suquet و همكاران، 2000).
از سال 1953 كه بلاكستر براي اولين بار عمل انجماد اسپرم را بر روي ماهي هرينگ به انجام رساند تا به امروز اين عمل بر روي تعداد زيادي از ماهيهاي آب شيرين و آب شور (بيش از 200 گونه) مورد آزمايش قرار گرفته است. محققين كشور نيز توانسته اند با موفقيت اسپرم ماهيان خاوياري(عابدي، 1375)، ماهي كپور (برادران نويري، 1377)، ماهي سفيد درياي مازندران(قاسمي، 1377) و قزل آلاي رنگين كمان (شكيبي دريا كناري،1380) را در شرايط سرمايي ذخيره سازي نمايند.
مراحل مختلف انجماد اسپرم
فرآيند انجماد اسپرم را مي توان به چهار مرحله ي زير تقسيم بندي نمود:
1-مرحله ي قبل از انجماد(جمع آوري اسپرم)
عمل جمع آوري اسپرم در طول فصل توليدمثل مولدين صورت مي پذيرد.اسپرم هاي استحصال شده از مولدين به لوله هاي سرد شده توسط يخ انتقال داده مي شود. عدم آلودگي اسپرم به ادرار،مدفوع موكوس، خون و موادي از اين دست ضروريست.اسپرم هاي جمع آوري شده براي ادامه ي مراحل انجماد در يخچال نگهداري شده و قبل از آغاز مراحل بعدي ، كيفيت اسپرم مورد بررسي قرار مي گيرد. اختلاف كيفيت اسپرم در بين گونه هاي مختلف به تناوب در تحقيقات مختلف گزارش شده است(Rana،1995). دليل اين اختلافات، تفاوت ژنتيكي، محل نمونه برداري اسپرم(از داخل بيضه يا از طريق منفذ تناسلي)، آلودگي اسپرم هاي نمونه گيري شده با ادرار و زمان برداشت اسپرم در طول فصل توليدمثل بيان شده است(Suquet و همكاران، 2000) . درآزاد ماهيان(Morisawa،1988) و در توربوت (Suquet و همكاران، 2000) برداشت اسپرم از منفذ تناسلي از طريق فشار به شكم ماهي در مقايسه با روش نمونه برداري از بيضه ، اسپرماتوزوئيدها تحرك بيشتري از خود نشان مي دهند. در مارماهي ژاپني، اسپرم هايي كه از داخل بيضه برداشت گرديدند بعد از فعال سازي در مقايسه با روش استحصال دستي تحرك كمتري داشتند(Ikedo و همكاران،1997).اسپرم هاي برداشت شده از بيضه بعد از اينكه در محلول نمكي با غلظت بالاي پتاسيم(K+) و بي كربنات(-Hco3) درمان گرديدند بطور مصنوعي تحرك طبيعي پيدا نموده و قابليت لقاح مشابه با روش ديگر داشتند(Ohata، و همكاران،1997).
به خاطر مجاورت لوله هاي اسپرم و لوله هاي ادراري، احتمال آلودگي نمونه هاي اسپرم با ادرار وجود دارد. اين پديده در گونه هاي آب شيرين گزارش گرديده (Rana،1995) اما بندرت در بين گونه هاي دريايي ديده شده است(Suquet و همكاران، 2000).آلودگي ادرار با اسپرم سبب كاهش درصد تحرك ، كاهش سرعت، نزول قابليت لقاح و كاهش قابليت نگهداري و ذخيره سازي اسپرم مي شود. غلظت ادرار و زمان نگهداري اسپرم بر تاثيرات ذكر شده مي افزايد. خالي نمودن ميزناي كليه قبل از عمل جمع آوري اسپرم ، به ميزان 3/9 درصد از آلودگي اسپرم به ادرا مي كاهد(Suquet و همكاران، 2000). در گونه هايي كه داراي اسپرم متراكم هستند (مانند سي باس)، به خاطر ويسكوزيته ي پايين و تغيير رنگ قسمتي از اسپرم كه با ادرار آلوده گرديده، آلودگي اسپرم به ادرار به آساني قابل تشخيص مي باشد(Fauvel و همكاران،1999).
در بسياري از گونه ها غلظت اسپرم با رسيدن به انتهاي فصل تكثير كاهش مي يابد(Fauvel و همكاران،1999).اسپرم اين گونه ها در ابتداي فصل توليدمثل در مقايسه با انتهاي آن داراي مدت تحرك بيشتري مي باشد(Billard و همكاران،1999). بنابراين، ميزان تحرك پايين، ميزان لقاح كم و كاهش قابليت نگهداري كوتاه مدتِ اسپرم در انتهاي فصل تكثير گزارش شده است(Suquet و همكاران، 2000).
توجه به نكات زير در هنگام جمع آوري اسپرم از مولدين براي حفظ كيفيت اسپرم به منظور انجماد و ذخيره سازي آنها ضروري مي باشد:
1- جمع آوري اسپرم بدون هيچ آلودگي به ادرار، مدفوع، خون يا فلس؛
2- نگهداري اسپرم جمع آوري شده در بهترين شرايط با فراهم نمودن هوا يا اكسيژن براي تنفس در طول انجام عمل استحصال اسپرم؛
3- نگهداري دماي اسپرم جمع آوري شده در 4 درجه ي سانتيگراد در طول جمع آوري و انتقال در محيط كار.
البته اسپرم هاي جمع آوري شده از هامور مالاباري مرده كه در دماي 4 درجه ي سانتيگراد نگهداري شده بود، براي چندين ساعت كيفيت خود را حفظ نمود(Chao و همكاران،2000).
2-انجماد
قبل از آغاز فرآيند انجماد نياز به تهيه ي محلول رقيق كننده و محافظت كننده مي باشد.
2-1- رقيق كننده
رقيق كننده ها محلول نمكي مي باشند كه براي رقيق سازي اسپرم استفاده مي شود. شايان ذكر است كه اسپرم رقيق نشده غير قابل انجماد مي باشد(Thomas،2003). علاوه بر وظيفه ي رقيق سازي اسپرم، جلوگيري از فعال شدن اسپرم و فراهم كردن محيطي براي اضافه نمودن محافظت كننده ها از ديگر كاربردهاي اين محلول مي باشد.
بيشترين رقيق كننده هاي مورد استفاده در انجماد اسپرم در ماهيهاي دريايي محلول نمكي (با غلظت 1-10 درصد) يا شكر (با غلظت 5-10 درصد) مي باشد(Suquet و همكاران، 2000). از آنجايي كه تحرك اسپرم وابسته به ذخاير ATP مي باشد، محلول رقيق كننده بايد از حركت اسپرم قبل از انجماد جلوگيري كند. با اين وجود در توربوت به عنوان يك گونه ي دريايي ، اضافه نمودن محافظت كننده از قبيل دي متيل سولفوكسيد با افزايش اسمولاليته به ميزان 1100 ميلي اسمول با ازاء هر كيلوگرم سبب القاء حركت اسپرم به مدت كمتر از يك دقيقه مي شود. اين فعاليت اسپرم قبل از انجماد تاثيري بر قابليت لقاح و تحرك آنها ندارد كه احتمالا به خاطر پديده ي سنتز دوباره ي ATP در طول فعاليت اسپرم در اين ماهي مي باشد(Dreanno و همكاران، 1997).
محلول رقيق كننده ي مونايب (ساكارز، بي كربنات پتاسيم، گلوتاتيئون و زرده ي تخم مرغ) براي انجماد اسپرم ماهيهاي دريايي، روغن ماهي، سي باس، توربوت و بسياري از ماهيهاي آب شيرين مناسب تشخيص داده شده است. وجود گلوتاتيئون در اين محلول از اثر تخريبي راديكال هاي آزاد(Maracine و Segner ، 1997) و پراكسيد شدن چربي ها جلوگيري كرده و از غشاء اسپرمي محافظت مي كند(Baulny، 1997).
در ايران انجماد و نگهداري اسپرم ماهي قزل آلاي رنگين كمان نشان داده كه با استفاده از رقيق كننده و محافظت كننده ي با تركيب تريس، زرده تخم مرغ، گلوكز و دي متيل سولفوكسيد بهترين نتايج حاصل مي گردد(شكيبي دريا كناري، 1380). اسپرم ماهي سفيد نيز با استفاده از تكنيك انجماد اسپرم مورد بررسي قرار گرفت. نتايج اين تحقيق نشان داد كه رقيق كننده ي Kurokura ، با تركيب كلريد كلسيم، كربنات سديم، كلريد منيزيم، كلريد پتاسيم، كلريد و آب مقطر بهترين محلول رقيق كننده براي انجماد اسپرم اين ماهي مي باشد(قاسمي،1377).
نسبت رقت اسپرم در رقيق كننده ها از 1 :1 تا 20:1 (حجم مايع مني به حجم رقيق كننده) متغير مي باشد.براي كفال مخطط و تيلاپيا نسبت 1:1 ، براي خامه ماهي 4:1 ، براي هامور 20:1 (Chao و Liao، 2001) ، براي قزل آلاي رنگين كمان 1: 3 (قاسمي،1377) گزارش گرديده است. در ماهي هامور در زمانيكه ميزان رقت مني از 10:1 به 100:1 تنزل پيدا كرد مدت زمان تحرك اسپرم از 40 دقيقه به 2 دقيقه كاهش يافت(Gwo، 1993). دليل علمي كه مي توان براي تفسير اين نتيجه ارائه نمود اينست كه پروتئين پلاسماي مني از قابليت بازماندگي و بقاء اسپرم حفاظت مي نمايد وكاهش رقت اسپرم به بيش از 10:1 باعث كاهش تاثير پروتئين پلاسماي مني و كاهش كيفيت اسپرم مي گردد(Billard،1983).
2-2- محافظت كننده ها
اين مواد شيميايي ، آسيب هاي ناشي از انجماد (تشكيل بلورهاي يخ)، بر روي سلول هاي جنسي، را به حداقل مي رساند.اين مواد شيميايي سرعت انتشار آب ازداخل سلول به خارج سلول راكاهش داده و از سرعت رشد كريستال هاي يخي مي كاهد.براي انتخاب يك محافظت كننده ي مناسب بايد به نكات زير توجه نمود:
الف- موادانتخابي بايد ميزان سميت پاييني داشته باشند؛
ب- قابل حل در آب باشند؛
ج- قابليت نفوذ به داخل سلول را دارا باشند.
معمولا محافظت كننده ها را به دو گروه نفوذ پذير و نفوذناپذير تقسيم مي كنند.اتيلن، پروفيلن گليكول، گليسرول، دي متيل سولفوكسيد و متانول جزء محافظت كننده هاي نفوذ پذير مي باشند. از جمله دلايل استفاده از اين نوع محافظت كننده ها سرعت نفوذ آنها به داخل اسپرم و واكنش بين آنها با فسفوليپيدهاي غشاء اسپرم بيان شده است(Baulny،1997). دي متيل سولفوكسيد رايج ترين محافظت كننده مورد استفاده در انجماد اسپرم ماهي مي باشد كه قابليت نفوذ پذيري آن متاثر از دما نيست و ميزان سميت آن بين گليسرول كه حداقل سميت و متانول كه بيشترين سميت را داراست ، قرار دارد(Thomas،2003). البته غلظت بالا دي متيل سولفوكسيد ((DMSO سمي بوده و مدت تحرك اسپرم برخي از گونه ها در غلظت بالاي اين ماده كاهش يافته است(Leung،1987؛ Gwo،1993). دي متيل سولفوكسيد، گليسرول، مخلوط دي متيل سولفوكسيد و گليسرول، پروپان اديول، دي متيل استامين و پلي اتيلن گليكول براي انجماد اسپرم آزاد ماهيان مورد استفاده قرار گرفت كه در اين ميان مخلوط 5 درصد دي متيل سولفوكسيد و يك درصد گليسرول مؤثرترين محافظت كننده گزارش گرديد(Lahnsteiner، و همكاران،1996).در آزاد ماهيان متانول تاثير معني دار در انجماد اسپرم هايي دارد كه نسبت اسپرم به تخم در هنگام لقاح پايين باشد(Lahnsteiner، و همكاران،1997).با وجود اين، متانول در انجماد اسپرم ماهيهاي دريايي بي تاثير بوده و يا اثر اندكي دارد(Suquet و همكاران، 2000).
در ماهيهاي آب شيرين محافظت كننده هاي نفوذناپذير ازقبيل پروتئين ها(BSA) يا ليپوپروتئين ها (زرده ي تخم مرغ)، ساكارز و گلوكز براي جلوگيري از وارد شدن آسيب به غشاء پلاسمايي رايج مي باشد(Scott و Baynes، 1980). اين مواد سبب افزايش مقاومت غشاء در برابر استرس هاي اسمزي و افزايش تحرك اسپرم ماهي قزل آلا رنگين كمان بعد از انجماد زدايي مي شود(Rana و همكاران، 1998).
2-3- ايجاد تعادل بين اسپرم و محلول رقيق كننده
مخلوط اسپرم و محلول رقيق كننده به منظور ايجاد توازن بين تركيبات محلول و سلول، براي مدت كوتاهي در دماي پايين نگهداري مي شوند. اين زمان بسته به نوع ماده ي محافظت كننده ي انتخابي متغير مي باشد. در مواردي كه از مواد نفوذپذير مانند گليسرول استفاده مي شود، به زمان بيشتري نياز خواهد بود.با تمام اين اوصاف اين زمان نبايد بيش از يك ساعت باشد. در غير اين صورت احتمال فعال شدن اسپرم ها در محلول رقيق كننده وجود دارد.افزايش زمان موازنه از 5 دقيقه به 60 دقيقه و افزايش غلظت DMSO از 10 به 30 درصد در ماهي سي باس ، سبب كاهش تحرك اسپرم بعد از خروج از حالت انجماد شده است(Gwo،1994). چنين اثري بعد از يك ساعت در كفال مخطط نيز ديده شده است(Chao و همكاران،1975). در مورد قزل آلاي رنگين كمان، براي نفوذ DMSO به داخل سلول 10 دقيقه زمان نياز است. اين مدت تاثيري بر روي كيفيت اسپرم ها نخواهد گذاشت(Suquet و همكاران، 2000). مخلوط گليسرول و DMSO به دليل سرعت نفوذ پايين گليسرول به مدت زمان بيشتري براي نفوذ به داخل سلول نياز خواهد داشت.
2-4- مرحله ي انجماد
معمولا از سه روش براي انجماد اسپرم استفاده مي شود(Thomas،2003):
1- روش پلت هاي يخي: اين روش براي انجماد اسپرم آزاد ماهيان بطور وسيع مورد استفاده قرار گرفته است. اندازه ي پلت ها ممكن است بين 20 تا 200 ميلي ليتر متغير باشد. سرعت انجماد اسپرم در اين روش 20 – 35 درجه سانتيگراد در هر دقيقه مي باشد. مخلوط اسپرم و محلول رقيق كننده را به حفره ي هاي كوچكي كه در يخ خشك تعبيه مي شود، انتقال مي دهند(دماي انجماد 79- درجه سانتيگراد). گلوله هاي يخ ايجاد شده به اين روش براي ذخيره سازي و نگهداري طولاني به نيتروژن مايع انتقال داده مي شود. در اين روش نيازي به نگهداري اسپرم در محلول رقيق كننده براي ايجاد تعادل و نفوذ محافظت كننده به داخل سلول نيست و مي توان بلافاصله اين مخلوط را منجمد نمود.
2- روش استفاده ي از لوله هاي باريك
لوله هاي باريك (استرو) در حجم هاي مختلف (25/0 تا 4 ميلي ليتر) براي انجماد اسپرم مورد استفاده قرار مي گيرد.اين روش به دليل حفظ كيفيت اسپرم پس از انجماد زدايي و كاهش فرصت كريستاليزه شدن دوباره ي اسپرم در طول انجماد زدايي ، در سال هاي اخير رواج بيشتر ي پيدا نموده است.بعد از انتقال مخلوط اسپرم و محلول رقيق كننده به اين لوله ها، ابتدا در بخار نيتروژن مايع و يا يخ خشك سرد شده و در ادامه به نيتروژن مايع انتقال داده مي شود. سرعت انجماد در اين روش در بين ماهيهاي آب شيرين 20 تا 160 درجه سانتيگراد در هر دقيقه و براي ماهيهاي آب شور بين 5 تا 150 درجه سانتيگراد در هر دقيقه گزارش شده است(Thomas و همكاران، 2003).
3- روش استفاده از ويال يا سرنگ
برخي از محقيقين از اين وسايل نيز براي ذخيره سازي و نگهداري اسپرم رقيق شده ي ماهيان استفاده نموده اند(Mounib،1978،براي ماهي آزاد اقيانوس اطلس و روغن ماهي ؛ Gupta و همكاران براي كپور).
2-5- مرحله ي ذخيره سازي
اسپرم هاي منجمد شده در مرحله ي قبلي را مي توان در دماي 196- درجه سانتيگراد در نيتروژن مايع براي مدت طولاني نگهداري نمود.
3- ذوب اسپرم هاي منجمد شده
براي جلوگيري از تشكيل دوباره ي بلورهاي يخ در سلولها ي جنسي در حين انجماد زدايي، ذوب سريع اسپرم هاي منجمد شده ضروريست. سرعت ذوب اسپرم در ماهيهاي دريايي پايين تر از ماهيهاي آب شيرين مي باشد( براي ماهيهاي آب شيرين 30-80 درجه ي سانتيگراد در هر دقيقه (Rana، 1995) و براي ماهيهاي دريايي از 1 تا 40 درجه ي سانتيگراد در هر دقيقه(Sequet و همكاران،2000) گزارش شده است). بطور معمول ظروف حاوي اسپرم در حمام آب گرم و پلت هاي يخي اسپرم مستقيما در محلول لقاح ذوب مي شوند(Lahnsteiner،2000). محلول لقاح مورد نياز براي ذوب پلت هاي اسپرمي آزاد ماهيان از كربنات سديم يك درصد و نمك طعام تشكيل مي شود(Thomas و همكاران، 2003). يك پلت به 1-2 ميلي ليتر محلول لقاح كه داري دماي 25-30 درجه سانتيگراد مي باشد، انتقال داده مي شود. بعد از 5-10 ثانيه اسپرم هاي منجمد شده، ذوب شده و مستقيما براي لقاح تخمك ها مورد استفاده قرار مي گيرند. كمترين تراكم اسپرم مورد نياز براي لقاح مناسب تخمك ها 106×3 اسپرم به ازاء تخمك گزارش گرديده است(Thomas و همكاران، 2003). لوله ي باريك حاوي اسپرم هاي منجمد شده نيز در حمام آب گرم با دماي 30-40 درجه سانتيگراد قرار داده مي شوند. از ميكروويو نيز براي ذوب لوله هاي باريك حاوي اسپرم هاي منجمد ماهي هامور استفاده شده كه نتايج خوبي از آن بدست آمده است. ويال هاي حاوي اسپرم منجمد نيز به 65-70 ثانيه زمان نياز دارند تا اسپرم ها به حالت اوليه برگردند. محاسبات نشان مي دهد كه ويال حاوي 3 ميلي ليتر اسپرم براي لقاح 100 الي 150 هزار تخمك كفايت مي كند(Thomas و همكاران، 2003).
ذوب اسپرم هاي منجمد شده از مهم ترين مراحل فرآيند انجماد اسپرم مي باشد و تخطي از شرايط نرمال و اپتيمال باعث كاهش معني دار درصد لقاح تخم مي شود. به عنوان مثال اگر زمان انجماد زدايي براي 5 ثانيه و يا دماي مورد نياز براي ذوب اسپرم آزاد ماهيان و اردك ماهي 5 درجه سانتيگراد تغيير كند، ميزان باروري اين اسپرم ها به طور معني داري كاهش مي يابد(Lahnsteiner،2000).
بعد از اينكه اسپرم ها از حالت انجماد خارج شدند، بايد بلافاصله مورد استفاده قرار گيرند. در ماهي توربوت يك ساعت بعد از انجماد زدايي از اسپرم، با وجود نگهداري آنها بر روي خرده هاي يخ، ميزان تحرك اسپرم 35 درصد كاهش يافت(Dreanno و همكاران، 1997). البته شايان ذكر است كه قرار دادن اسپر م هاي ذوب شده در داخل مايعي شبيه به مايع مني، قابليت نگهداري كوتاه مدت اسپرم را افزايش مي دهد(Sequet و همكاران،2000).
قبل از استفاده ي از اسپرم هاي ذوب شده بايد به نكات زير توجه شود:
1- تعيين تحرك اسپرم به عنوان راهنمايي براي برآورد موفقيت لقاح؛
2- كاهش زمان بين ذوب كردن اسپرم هاي منجمد شده و انجام عمل لقاح؛
نسبت رقت اسپرم: از آنجايي درصد موفقيت لقاح در ارتباط با غلظت اسپرم مي باشد و از طرف ديگر تمام اسپرم هاي منجمد شده در طول فرآيند انجماد كيفيت خود را حفظ نمي كنند، لذا لازم است كه در هنگام انجام عمل لقاح ميزان تراكم اسپرم هاي ذوب شده بالاتر از اسپرم هاي تازه باشد.
منابع
1- کلباسی، محمدرضا،جزوه ی درسی تکثیر و پرورش تکمیلی آبزیان، دوره ی کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس،1382.
2-کیوان شکوه، سعید، مروری بر عملکرد پژوهشی دانشگاه ها و مراکز تحقیقات علوم شیلاتی در زمینه ژنتیک آبزیان در ایران، سمینار کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده ی علوم دریایی نور، 1380.
3- Babiak, I., Glogowski, J., Brzuska, E., Szumiec, J., Adamek, J.,
Cryopreservation of sperm of common carp, Cyprinus carpio L. Aquac.
Res. 28, 567–571, 1997.
4- Blaxter, J.H.S., Sperm storage and cross fertilization of spring and autumn spawning herring. Nature 172:1189-1190, 1953.
5-Holtz, W., cryopreservation of rainbow trout sperm: practical recommendations. Aquaculture, 110:97-100, 1993.
6-Lanhnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R.A., Methanol as cdyoprotectant and the suitability of 1/2 ml and 5 ml straw for cryopreservation of semen from salmonid fishes, Aquaculture Research, 28, 471-479,1997.
7- Lanhnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R.A., A uniform method for cryopreservation of semen of the salmonid fishes Oncorhynchus mykiss, Salmo trutta fario, Salmo trutta, Coregonus sp., Aquaculture Research, 26:801-807,1995.
8- Mounib, M. S., Cryogenic preservation of fish and mammalian spermatozoa.J.Repord. Fertil.53:13-18, 1978.
9-Rana, K. 1995. Preservation of gametes in Broodstock Management and Egg and Larval Quality. N. R. Bromage and R. J. Roberts, editors. University Press, Cambridge, England. Pp. 53–75.
10- Suquet, M., Dreanno, C., Fauvel, C., Cosson, J., Billard, R., Cryopreservation of sperm in marine fish. Aquaculture Research,31:231-243, 2000.
11-Thomas, P.C., Rath, S.C., Mohapatra, D.K. Breeding and seed production of Fin fish and Sellfish. Daya puplishing house. 2003
كنترل هورموني رشد و رسيدگي نهايي تخمك در ماهيان استخواني عالي
سيد مرتضي ابراهيم زاده
دانش آموخته ي دانشگاه تربيت مدرس-مقطع كارشناسي ارشد
چكيده
توليدمثل در ماهيها بوسيله ي فرآيندهاي درونزا كنترل مي گردد. اين فرآيندهاي داخلي از طريق عوامل محيطي از قبيل نور، دما و عوامل غذايي تحريك مي شوند. با توجه به اطلاعات موجود اين امر آشكار گرديده كه توليد سلول جنسي در ماهيها، همانند ساير مهره داران ، بوسيله ي سيستم غدد درون ريز شامل مغز(هيپوتالاموس)، غده ي هيپوفيز و غدد جنسي كنترل مي گردد. سيستم كنترل غدد درون ريز توليدمثل در ماهيان باله دار بر اساس محور هيپوتالاموس – هيپوفيز- غدد جنسي، مشابه ي پستانداران، مي باشد. هيپوتالاموس هورمون آزاد كننده ي گنادوتروپين (GnRH) كه بر هيپوفيز تاثير مي گذارد ،را توليد مي نمايد. اين غده سنتز و رهاسازي هورمون هاي گنادوتروپين (GtHs) كه نقش آن سوق دادن غدد جنسي(تخمدان و بيضه) به سمت توليد سلول هاي جنسي مي باشد، را كنترل مي كند(ابراهيم زاده،1386). گنادوتروپين هاي سنتز شده در گنادوتروپ هاي غده ي هيپوفيز، به داخل چرخه ي خوني محيطي ترشح شده و از طريق اتصال به گيرنده هاي واقع در غدد جنسي سبب القاء فرآيند استروئيدوژنز و گامتوژنز در ماهيها مي گردد.
به دليل نقش اصلي سيستم غدد درون ريز در توليد سلول هاي جنسي، دانستن عمل كنترل و تنظيم هورموني توليدمثل ماهيها، به ما در استفاده ي بهينه از هورمون هاي مختلف در تكثير مصنوعي ماهي كمك شاياني خواهد نمود.در اين مقاله نقش سيستم غدد درون ريز و گنادوتروپين هاي مترشحه از هيپوفيز در تنظيم فرآيند رشد و رسيدگي نهايي تخمك در ماهيها مرور خواهد شد.
مقدمه
توليدمثل در ماهيها بوسيله ي فرآيندهاي درونزا كنترل مي گردد. اين فرآيندهاي داخلي از طريق عوامل محيطي از قبيل نور، دما و عوامل غذايي تحريك مي شوند.در مناطق معتدله تغييرات فصلي طول روز عامل مهم در آغاز رسيدگي غدد جنسي مي باشد. در نتيجه ي اين هماهنگي فصلي ، توليد نوزادان در فصلي انجام مي پذيرد كه شرايط تغذيه ايي لاروها در بهترين حالت قرار دارد. چرخه ي توليدمثلي اساسا بوسيله ي هورمون كنترل و تنظيم مي گردد. اين كنترل اصطلاحا توسط محور مغز-هيپوفيز-غدد جنسي صورت مي پذيرد.
نور از طريق چشم ها و غده ي پينه آل يا غده ي صنوبري كه در بالاترين قسمت مغز جلويي قرار دارد، بر فرآيند هاي داخلي ماهي تاثير مي گذارد. غده ي صنوبري ملاتونين را ترشح مي كند. سطح ترشحي ملاتونين به سطح نور موجود در محيط بستگي دارد.بطوريكه بيشترين توليد ملاتونين در تاريكي انجام مي گيرد. ماهيهايي كه در مناطق معتدله بسر مي برند ، معمولا به تغييرات طول روز( و ماهيهاي گرمسيري به سيكل گردش ماه) حساس مي باشند. در نتيجه ي تغييرات فصلي در توليد ملاتونين به همراه ريتم هاي درونزاي ماهي ، توليد هورمون آزاد كننده ي گنادوتروپين (GnRH) در هيپوتالاموس تحريك مي گردد(Pavlov و همكاران،2007). هفت نوع هورمون آزاد كننده ي گنادوتروپين در مهره داران شناسايي گرديده كه تا به امروز دو نوع از اين هورمون در ماهيان استخواني عالي مورد شناسايي قرار گرفته است. GnRH-II جوجه (cGnRH-II) و GnRH آزاد ماهيان (sGnRH) در مغز تعدادي از ماهيان استخواني از قبيل ماهي طلايي، قزل آلاي رنگين كمان، آزاد ماهيان و سوف ماهيان دريايي وجود دارد (Kahو همكاران، 1993).هورمون آزادكننده ي گنادوترپين به غده ي هيپوفيز (كه متصل به هيپوتالاموس مي باشد) منتقل شده و سبب القاء رسيدگي جنسي از طريق تحريك سلول هاي عصبي- ترشحي ويژه در هيپوفيز براي توليد و ترشح دو نوع هورمون گنادوتروپين (GtH-I=FSH= هورمون محرك فوليكول و GtH-II=LH= هورمون محرك جسم زرده) مي گردد. گنادوتروپين هاي سنتز شده در گنادوتروپ هاي غده ي هيپوفيز، به داخل چرخه ي خوني محيطي ترشح شده و از طريق اتصال به گيرنده هاي واقع در غدد جنسي سبب القاء فرآيند استروئيدوژنز و گامتوژنز در ماهيها مي گردد.
كنترل هورموني رشد و رسيدگي نهايي تخمك
تخمدان در ماهيان استخواني از اووگونيا، اووسيت، سلول هاي فوليكولي محاط كننده ي تخمك، بافت هاي حمايتي يا استروما و بافت عروقي و عصبي تشكيل شده است(ابراهيم زاده،1382) .با رشد اووسيت ها، سلول هاي فوليكول چند لايه مي گردند. اين لايه ها عبارتند از لايه سلولي دانه دار يا گرانولوزا و لايه ي تك . بنابر اين اووسيت در مرحله ي زرده سازي مانند ساير مهره داران، داراي دو لايه ي سلولي اصلي _ يك لايه سلولي در بيرون (لايه ي تك) و يك لايه سلولي داخلي (لايه ي گرانولوزا) _ مي باشد كه بوسيله ي يك غشاء پايه از همديگر جدا مي گردند. لايه ي تك از سلول زاينده ي بافت پيوندي (فيبروبلاست)، فيبرهاي كلاژن و مويرگ و در برخي از گونه ها سلول هاي ويژه تشكيل شده است(Nagahama،1994).در مرحله ي ابتدايي رشد، تخمك ها در مرحله ي پروفاز تقسيم ميوز متوقف مي شوند. با وجود اين تخمك ها به رشد خود ادامه داده و در مرحله ي زرده سازي يا ويتلوژنز به حداكثر رشد خود مي رسند(ابراهيم زاده،1382). مواد تشكيل دهنده ي زرده ي تخم (ويتلوژنين) در اين مرحله از كبد از طريق جريان خوني وارد اووسيت مي گردد. با توجه به اينكه گنادوتروپين باعث تحريك سنتز 17- بتا- استراديول(E) مي شود كه در حقيقت محرك سنتز ويتلوژنين كبدي مي باشد، حذب ويتلوژنين بوسيله ي اووسيت توسط گنادوتروپين نوع اول و احتمالا ديگر فاكتورهاي رشدي تحريك و كنترل مي گردد(Tyler و همكاران،1991) در طول رشد تخمك ، پوسته ي تخم يا پوسته ي ويتلين ، بين سلول هاي لايه ي گرانولوزا و غشاء اووسيت تشكيل مي شود. پوسته ي تخم حاوي يك لايه ي نازك بيروني و لايه ضخيم دروني مي باشد(Swanson، 1994). پروتئين هاي زنورادياتا (Zr) از جنس گليكوپروتئين بوده كه در كبد در پاسخ به ترشح 17- بتا- استراديول(E) توليد مي گردند(Oppen-Berntsen و همكاران،1992).
در تعداد زيادي از ماهيان استخواني عالي، مشخص گرديده كه در طول رشد تخمك، سطح پلاسمايي 17- بتا- استراديول(E) افزايش يافته و در ادامه، قبل از رسيدگي نهايي تخمك، مقدار آن كاهش مي يابد. توليد 17- بتا- استراديول(E) توسط سلول هاي فوليكولي تخمدان آزاد ماهيان به سلول هاي ويژه ايي از هر دو لايه ي سلولي تك و گرانولوزا نيازمند مي باشد.تستوسترون (T) توسط سلول هاي لايه ي تك توليد شده و توسط آنزيم آروماتاز در سلول هاي لايه ي گرانولوزا به 17- بتا- استراديول(E) تبديل مي گردد. در گونه هاي ديگر سلول ويژه لايه ي تك وجود نداشته و سلول هاي لايه گرانولوزا مكان اصلي توليد استروئيدها مي باشند(Swanson، 1994). در آزاد ماهيان مشاهده گرديده كه سطح هورمون گنادوتروپين نوع اول ارتباط معني داري با سطح هورمون 17- بتا- استراديول و پروتئين هاي لايه ي زونارادياتا دارد(Oppen-Berntsen و همكاران،1992)..بنابراين توليد ويتلوژنين و پروتئين هاي پوسته ي تخم در آزاد ماهيان احنمالا بطور غير مستقيم توسط گنادوتروپين نوع اول از طريق تاثير آن بر روي توليد استراديول ، انجام مي گيرد(Swanson، 1994).
در ادامه ي رشد تخمك، شاهد فرايند هاي رسيدگي نهايي(FOM)(شروع دوباره ي تقسيم ميوز) و تخمك گذاري (اوولاسيون) در تخمدان ماهيها مي باشيم. تحقيقات انجام شده بر روي ماهيهاي مختلف نشان مي دهند كه گنادوتروپين ها از طريق توليد هورمون هاي القاء كننده ي رسيدگي جنسي (MIH) در آغاز رسيدگي نهايي تخمك توسط سلول هاي فوليكولي مؤثر مي باشند(Thomas و همكاران ،2003). در شرايط آزمايشگاهي هورمون هاي استروئيدي مختلفي در القاء رسيدگي تخمك مؤثر واقع شده اند كه برخي از آنها عبارتند از: 17-آلفا-هيدروكسي پروژسترون( 17-OHP) ، 17 - آلفا- 20- بتا- دي هيدروكسي – 4 پريژنن -3- وان (17a,20B-DP)، 17 - آلفا- 20- بتا- 21- تري هيدروكسي – 4 پريژنن -3- وان(20-s)، كورتيزول، دي اكسي كورتيكواسترون (Swanson، 1994).
در آزاد ماهيان گنادوتروپين سبب تحريك سلول هاي لايه ي تك براي توليد 17-آلفا-هيدروكسي پروژسترون مي گردد. اين هورمون در سلول هاي لايه ي گرانولوزا در اثر فعاليت آنزيم 20-بتا-هيدروكسي استروئيد دي هيدروژناز(20B-HSD) به 17 - آلفا- 20- بتا- دي هيدروكسي – 4 پريژنن -3- وان(17a,20B-DP) تبديل مي شود(Nagahama،1987). هورمون هاي القاء كننده ي رسيدگي جنسي سبب توليد فاكتور پيش برنده ي رسيدگي جنسي (MPF) در سيتوپلاسم اووسيت مي گردد. اين ماده باعث تغييرات زير در اووسيت مي گردد:
-
مهاجرت هسته به قطب حيواني اووسيت در جهت ميكروپيل؛
-
شكست هسته(GVB ): غشاء هسته از بين رفته و تركيبات آن با سيتوپلاسم مخلوط مي گردد؛
-
تقسيم دوم ميوزي آغاز شده و اين فرآيند در مرحله ي متافاز متوقف مي گردد(Thomas و همكاران ،2003).
در فوليكول آزاد ماهيان قبل از تخمك گذاري(اوولاسيون) هر دو نوع گنادوتروپين در تحريك سلول هاي لايه ي تك براي توليد 17-آلفا-هيدروكسي پروژسترون نقش دارند ولي گنادوتروپين نوع دوم در تبديل 17-آلفا-هيدروكسي پروژسترون به 17 - آلفا- 20- بتا- دي هيدروكسي – 4 پريژنن -3- وان1 مؤثرتر مي باشد.افزايش توانايي گنادوتروپين نوع دوم در طول اين مرحله با ظهور گيرنده هاي ويژه ي GtH-II بر روي لايه ي گرانولوزا همراه مي باشد. بعد از مرحله ي زرده سازي، توانايي فوليكول براي توليد 17- بتا- استراديول كاهش يافته و از فعاليت آنزيم آروماتاز در سلول هاي گرانولوزا بطور چشمگير كاسته مي شود و در عوض فعاليت آنزيم 20-بتا-هيدروكسي استروئيد دي هيدروژناز(20B-HSD) افزايش مي يابد. در اين زمان توانايي سلول هاي تك در پاسخ به افزايش گنادوتروپين براي توليد تستوسترون افزايش يافته و درست قبل از رسيدگي نهايي تخمك توليد 17-آلفا-هيدروكسي پروژسترون( 17-OHP) توسط سلول هاي تك گسترش مي يابد(Swanson، 1998). بنابراين، GtH- II پلاسما درست قبل از رسيدگي نهايي اووسيت افزايش يافته و باعث تعويض توليدات استروئيدوژنيك (17- بتا استراديول و استرون در ماهيان ماده) با توليدات پروژستونيك (مانند 17- آلفا- 20- بتا- دي هيدروكسي – 4 پروژنن -3- وان و 17- هيدروكسي پروژسترون) در سلول هاي لايه ي تك تخمك مي گردد(ابراهيم زاده،1386).توليد 20-بتا-هيدروكسي استروئيد دي هيدروژناز(20B-HSD) نيز توسط گنادوتروپين نوع دوم كنترل مي گردد چون سطح پلاسمايي اين ماده در اين دوره افزايش يافته و گيرنده هاي GtH- II واقع در لايه ي گرانولوزا نيز در اين زمان گسترش مي يابند(Swanson، 1994).
منبع:
سيد مرتضي ابراهيم زاده
دانش آموخته ي دانشگاه تربيت مدرس-مقطع كارشناسي ارشد
-
ابراهيم زاده، سيد مرتضي؛ كنترل توليدمثل در ماهيان استخواني از طريق هورمون آزاد كننده ي گنادوتروپين(GnRH)،پايگاه اطلاع رساني شيلات ايران(www.shilat.com)، 1386
-
ابراهيم زاده، سيد مرتضي؛ نحوه ي رشد و تكامل اووسيت در ماهيان استخواني عالي، سمينار دوره ي كارشناسي ارشد، دانشگاه تربيت مدرس، 1382
-
Kah O, Anglade I, Lepretre E, Dubourg P, and de Monbrision D,1993. The reproductive brain in fish. Fish Physiol Biochem 11:85-98
-
MIURA, T., YAMAUCHI, K., NAGAHAMA, Y. and TAKAHASHI, H. (1991). Induction of spermatogenesis in male Japanese eel, Anguilla japonica, by a single injection 01 human chorionic gonadotropin. Zool. Sci. 8: 63-73
-
MOAISAWA, S. and MORISAWA, M. (1986). Acquisition of potentia! for sperm motility in rainbow trout and chum salmon. J. Exp. Bioi. 126: 89-96.
-
Nagahama, Y.(1994), Endocrine regulation of gametogenesis in fish.Int. J. Biol. 38:217-229
-
Pavlov, D.A.; Emel’yanova, N.G.; Novikov, G.G.; Reproductive dynamics, unpublish
-
Thomas P.C., Rath S.C., Mohapatra D.K. (2003), Breeding and seed production of Fin fish and Sellfish. Daya puplishing house
تكثير مصنوعي صدف هاي دوكفه اي
سيد مرتضي ابراهيم زاده
دانش آموخته ي دانشگاه تربيت مدرس-مقطع كارشناسي ارشد
چكيده
در حال حاضر، صدف هاي دوكفه اي، بخش مهمي از توليدات شيلاتي را به خود اختصاص مي دهند. بر اساس آمار ارائه شده توسط فائو، در سال 2002، بيش از 11 ميليون تن صدف از طريق فعاليت هاي آبزي پروري حاصل شده است؛ بطوريكه با رشد 6/4 درصدي نسبت به سال 2000، بعد از ماهيان آب شيرين، جزو دومين گروه آبزي پرورشي ، قرار گرفته اند. پيش نياز هر فعاليت پرورشي، فراهم كردن منابعِ فراوان، قابل اتكا و ارزان بذر و لاروِ آبزي مورد نظر مي باشد. در حال حاضر لارو صدف هاي پرورشي از طبيعت بدست مي آيدكه توليد لارو بصورت مصنوعي در تفريخگاه ها جايگزين مناسبي براي تهيه ي لارو مورد نياز آنها براي پرورش مي باشد. اساس كار بسیار از سالن هاي تكثير صدف هاي دوكفه اي، مشابه بوده و شامل روش هاي آماده سازي و تخم ريزي صدف هاي بالغ، پروش لارو، پرورش صدف هاي جوان تا اندازه ي قابل قبول و تسهیلات لازم براي توليد جلبك به عنوان غذاي صدف ، مي باشد.با توجه به فراهم بودن شرايط پرورشي صدف در كشور، چه از لحاظ وجود گونه هاي بومي و چه از طريق وارد نمودن گونه هاي مهم پرورشي، دانستن اصول تكثير مصنوعي آنها ضروري به نظر مي رسد. در اين مقاله قصد بر آن بوده كه مهمترين نكات مورد نياز براي تكثير مصنوعي صدف هاي دوكفه اي ارائه گردد.
آماده سازي مولدين
براي بسياري از گونه هاي دوكفه ايِ مناطق معتدله، تكامل غدد جنسي زمانيكه دماي آب به بيش از 10-14 درجه سانتيگراد برسد،آغاز مي گردد. در اين دما، سلول هاي جنسي در ماههاي فروردين _ ارديبهشت نمو نموده و در ماههاي مرداد- شهريور به رسيدگي كامل مي رسند. صدف ها تحت تاثير محرك هايي مانند افزايش دما و شوك حرارتي يا دستكاري، تحريك به تخم ريزي مي شوند. در تفريخگاهها زمان رسيدگي جنسي را مي توان بوسيله ي نگهداشتن مولدين در دماي بالا با جيره غذايي مناسب، به جلو انداخت.
كلم هاي(clam ) با طول 8 ميلي متر (با وزن 80 ميلي گرم) را مي توان به عنوان مولد مورد استفاده قرار داد، اما از آنجايي كه با افزايش اندازه ي بدن، ميزان تخم توليد شده نيز افزايش مي يابد، استفاده از صدف هاي بالغِ بزرگتر به طول 35-40 ميلي متر (10-20 گرم) معمول است. اين صدف ها 5-8 ميليون تخم توليد مي نمايند. تمام كلم ها ابتدا جنس نر پيدا كرده و سپس با افزايش سن به جنس ماده تغير جنسيت مي دهند يا همان جنس را حفظ مي نمايند
در اويستر(oyster ) نيز ابتدا دستگاه توليدمثلي نر ايجاد شده و سپس صدف ها به جنس ماده تغيير جنسيت مي دهند و يا بصورت صدف نر باقي مي مانند.اويسترهاي 65-70 ميلي متري (30 گرمي) را مي توان به عنوان مولد مورد استفاده قرار داد. هر مولد ماده ي اويستر صاف با اين وزن بيشتر از يك ميليون لارو توليد مي نمايند.
اسكالوپ هاي رسيده(scallop ) با طول 90-120 ميلي متر بعنوان مولد در تفريخگاهها مورد بهره برداري قرار مي گيرند. در اين نوع صدف ها سلول هاي جنسي نر وماده با هم در بدن يك صدف قرار دارند. در هنگام رسيدگي كامل تخمدان و بيضه بر اساس تفاوت رنگي موجودِ بين آنها قابل تمايز مي باشند. تخمدان به رنگ قرمز_ نارنجي و بيضه به رنگ سفيد در مي آيد(تصوير -2). با مديريت دقيق و تغذيه صحيح، توليد 20 ميليون تخم از هر اسكالوپ قابل انتظار است.
روش آماده سازي مولدين
در ابتدا، صدف هاي بالغ، از دريا به تفريخگاه انتقال داده مي شوند. در تفريخگاهها، صدف ها بر روي سيني هاي مخصوص قرار مي گيرند
كلم (clam) و اسكالوپ(scallop)، در صورتي كه كف سيني ها داراي شن و ماسه درشت و زبر باشد، بطور طبيعي براي تخم ريزي آماده مي گردد. صاف كردن آب دريا ضرورتي ندارد؛ چون تنوع و فراواني غذاي طبيعي در اين آب ها بالا مي باشد و در صورت صاف كردن آب دريا اين مواد غذايي با ارزش كه براي آماده سازي مولدين بسيار مفيد است، از دسترس خارج مي گردد. اويستر و كلم نياز به آب با شوريِ بيش از 25 پ.پ.تي و دماي 2+22 درجه سانتيگراد دارند. شوري آب براي آماده سازي اسكالوپ، بيش از 30 پي.پي.تي در نظر گرفته مي شود و دماي آب در ابتدا به 9 درجه سانتيگراد و با افزايش يك درجه اي در هر هفته، حداكثر به 16 درجه سانتيگراد رسانده مي شود. جريان آب بايستي 25 ميلي ليتر در دقيقه به ازاء هر صدف تنظيم گردد. تراكم ذخيره سازي 8-12 گرم وزن زنده ي صدف در هر تانك برآورد مي گردد. گونه هاي پرورشي جلبك هاي دريايي غذاي اصلي مولدين در هنگام آماده سازي مي باشد. تتراسلميس (Tetraselmis)، تالاسيوسيرا (Thalassiosira) و اسكلتونما (Skeletonema) از جلبك هايي هستند كه براي آماده سازي مولدين مورد استفاده قرار مي گيرد. هر مولد به 200 ميليون سلول تتراسلميس، 2000 ميليون سلول تالاسيوسترا يا 1000 سلول اسكلوتنما در هر روز نياز دارند. مخلوطي از اين گونه ها غذاي مناسب تري براي صدف هاي مولد در مقايسه با استفاده ي تك گونه اي آنها مي باشد. مولدين 6-8 هفته (اويستر يا كلم ) و 5-11 هفته (اسكالوپ) تا رسيدن به شرايط تخم ريزي در زمستان و اوايل بهار در اين تانك ها نگهداري مي شوند. زمان نگهداري مولدين در اين تانك ها، بوسيله واژه درجه – روز تعيين مي گردد:
D0 =d (t-t0)
D0= تعداد روز – درجه ي تصحيح شده
d = تعداد روزها تا زمان تخم ريزي
t = ميانگين دماي محيط
t = حداقل دما براي شروع تكامل غدد جنسي
در اقليم معتدل كه t0 براي بسياري از دوكفه اي ها بين 10-14 درجه سانتيگراد مي باشد، ميزان D0، 300-500 مي باشد.به عنوان مثال اگر ميانگين دماي آماده سازي 20 درجه سانتيگراد باشد و حداقل دما براي تكامل غدد جنسي 10 درجه باشد، صدف ها ظرف مدت 30-50 روز به مرحله تخم ريزي مي رسد.
رشد و نمو غدد جنسي
در بيشتر صدف هاي دوكفه اي رسيدگي جنسي به اندازه بدن جانور بستگي دارد و ارتباطي با سن آنها ندارد. اندازه ي آنها نيز تابعي از نوع گونه و پراكنش جغرافيايي آنها مي باشد. علاوه بر اندازه ي صدف، دماي آب و كميت و كيفيت غذا در آغاز فرآيند توليد تخم و اسپرم مؤثر مي باشد. غدد جنسي حاوي لوله هاي منشعب و مژه دار با تعداد زيادي فوليكول مي باشد. سلول هاي جنسي از طريق تقسيم سلول هاي زاينده (ژرمينال) كه در ديواره ي فوليكول قرار دارند، توليد مي گردند. در مراحل اوليه توليد سلول هاي جنسي ابتدا فوليكول تشكيل مي شود. در اين زمان غدد جنسي از لحاظ جنسيت قابل تمايز نيستند. با ادامه نمو فوليكول، تخم هاي اوليه (اووگونيا) بر روي ديواره ي فوليكول جوانه مي زند. در صدف هاي نر به اين سلول هاي جنسي اسپرماتوگونيا مي گويند. در مرحله ي تشكيل اووگونيا يا اسپرماتوگونيا ثانويه تقسيم ميوزي اتفاق مي افتد. در صدف هاي ماده جوانه زدن ادامه پيدا كرده و اووسيت پايه دار تشكيل مي شود. پايه ها، اووسيت را به ديواره ي فوليكول متصل مي كنند. در اين زمان هسته مشخص شده و هستك ظاهر مي گردد.در هنگام رسيدگي كاملِ غدد جنسي، ديواره ي فوليكول نازك و غشاء مانند بوده و اووگونيا در آنها ديده نمي شوند. در صدف هاي نر، غدد جنسي پر از اسپرماتوسيت هاي رسيده مي باشند كه ناحيه دم آنها در جهت مركز غدد جنسي مي باشد. در صدف هاي ماده نيز ديواره فوليكول نازك و فوليكول پر از اووسيت هاي رسيده مي باشد. در اين مرحله اووسيت ها فاقد پايه بوده و هستك ها نيز غير قابل ديد مي گردند. فوليكول ها بوسيله يكسري مجراي مژه دار به منفذ تناسلي متصل مي باشند. در طول تخم ريزي، اسپرماتوسيت ها و اووسيت ها بوسيله ي اين مجرا مژه دار به سمت منفذ تناسلي هدايت شده و به داخل آب رها مي گردند. قبل از رسيدگي كامل، اويستر ها گليكوژن را در بافت هاي پيوندي ، به خصوص در جبه، ذخيره مي كنند. از اين رو جبه قبل از تخم ريزي حالت ضخيم و شيري رنگ پيدا مي كند. بعد از تخم ريزي، جبه نازك و شفاف مي گردد. در هنگام نمو غدد جنسي، چربي ها در لوله هاي گوارش ذخيره شده و سوخت وساز بدن از منبع چربي به منبع گليكوژن تغيير مي يابد تا چربي ذخيره گردد. اين ذخاير چربي براي تشكيل سلول هاي جنسي مورد استفاده قرار خواهد گرفت. اين فرآيند بوسيله ي نازك شدن جبه (خالي شدن ذخاير گليكوژن) مشخص مي گردد.
غدد جنسي رسيده كاملاً مشخص بوده و بخش اعظمي از بافت نرم بدن صدف را تشكيل مي دهد. مجراي غدد جنسي كه حامل سلول هاي جنسي به داخل حفره ي بدن مي باشد كاملاً نمو يافته و طويل مي گردند. روش هاي مختلفي براي تعيين رسيدگي جنسي در صدف ها وجود دارد كه دقيق ترين روش، روش تهيه ي برش هاي بافت شناسي از غدد جنسي مي باشد. اما اين روش پر هزينه و زمان بر بوده و جاندار بعد از نمونه برداري از بين مي رود. تهيه ي نمونه ي كوچك از غدد جنسي و بررسي آن در زير ميكروسكوپ روش مناسب و متداول تعيين رسيدگي جنسي در صدف ها مي باشد.
تخم ريزي در صدف ها تحت تاثير عوامل مختلف محيطي از قبيل محرك هاي فيزيكي و شيميايي، جريان آب يا تركيبي از اين عوامل صورت مي پذيرد. وجود اسپرم در آب باعث انجام تخم ريزي در صدف هاي ماده مي گردد. در اكثر گونه هاي صدف هاي تجاري، لقاح خارجي بوده و در داخل آب صورت مي گيرد. در اين صدف ها ، اسپرم ها بصورت جريان يكنواخت و نامتناوب از سيفون خروجي از بدن خارج مي گردد. بر خلاف صدف هاي نر، در جنس ماده، تخم ها بطور متناوب و بصورت توده اي از طريق سيفون وارد محيط آبي مي گردد در اسكالوپ يا اويستر جنس ماده بطور متناوب كفه هاي خود را باز بسته مي كنند تا تخم هاي كه بر روي آبشش قرار گرفته اند، خارج گردد. برخي از صدف هاي دو كفه اي مانند اويستر پهن، مراحل ابتدايي رشد(مرحله لاروي) در حفره داخلي جبه ي جنس ماده انجام مي گيرد. تخم ها از طريق آبشش وارد اين حفره شده و اسپرم نيز از طريق منفذ ورودي، داخل بدن صدف ماده مي گردد و لقاح در بدن اين جانور انجام مي گيرد.
تخم ريزي
صدف هاي رسيده را مي توان از طريق بكار بردن محرك هاي خاص وادار به تخم ريزي نمود. روش هاي مختلفي براي القاء تخم ريزي در صدف ها وجود دارد. استفاده از شوك حرارتي و محرك هاي شيميايي مانند سروتونين و آب اكسيژنه از جمله اين روش ها مي باشد. اما شوك حرارتي يا چرخه ي دمايي رايج ترين روش براي القاء تخم ريزي در دوكفه اي ها مي باشد. روند كار به اين صورت است كه ، صدف هاي رسيده از تانك هاي آماده سازي مولدين خارج گرديده و سطح خارجي آنها تميز مي گردد. سپس به تانك هاي تخم ريزي انتقال داده مي شوند. يك سيني يا تراف فايبرگلاسي به ابعاد 15×50×150 سانتيمتر براي اين كار مناسب مي باشد.اين ظروف داراي دو لوله ي آب است كه يكي داراي دماي 12-15 درجه و ديگري 25-28 درجه سانتيگراد مي باشد. معمولاً دماهاي پايين تر براي گونه هاي سرد آبي مورد استفاده قرار مي گيرد. كف سيني يا تراف با پوشش تيره رنگ پوشانده مي شود(تصوير -6 ). رنگ تيره كف سيني باعث مي گردد كه سلول هاي جنسي رها شده بلافاصله قابل ديد گردند. تراف ها ابتدا با آب خنك تا عمق 10 سانتيمتر پر شده و مقدار كمي جلبك هاي پرورشي براي تحريك صدف ها به منظور آغاز فعاليت سيفون ها و پمپ كردن آب، به تراف اضافه مي گردد. بعد از گذشت 15-30 دقيقه آب تخليه و دوباره با آب تازه با دماي 28-30 درجه سانتيگراد جايگزين مي گردد. به اين آب نيز مقداري جلبك پرورشي اضافه مي شود. 15-30 دقيقه بعد براي بار دوم اين آب تخليه شده و آب خنك به تراف ها ريخته مي شود. اين فرآيند چند بار تكرار مي گردد. تعداد چرخه ي دمايي كه براي القاء تخم ريزي در صدف ها به كار مي رود به رسيدگي جنسي آنها بستگي دارد. معمولاً در ابتدا فصل تخم ريزي اين چرخه 4-6 ساعت تكرار مي شود ، اگرچه در برخي اوقات در مدت يك ساعت تخم ريزي القاء مي گردد.
در هنگام القاء، معمولاً، صدف نر ابتدا سلول هاي جنسي خود را رها مي سازد. از محرك هاي اضافي مانند اضافه نمودن سوسپانسيون تخم يا اسپرم صدف به محيط آب تراف ها نيز مي توان استفاده نمود. با خارج نمودن مقداري سلول جنسي از بدن صدف و ريختن آنها در داخل حجم كمي از آب صاف شده ي دريا سوسپانسيوني از سلول هاي جنسي بدست مي آيد كه به عنوان محرك هاي اضافي به محيط تراف اضافه مي گردد. ورود اين سلول ها به داخل حفره ي جبه، صدف را تحريك به تخم ريزي مي كند. از آن جايي كه ابتدا صدف هاي نر وادار به رها سازي اسپرم مي گردند، بهتر است تا حصول تخم از صدف هاي ماده، به منظور جلوگيري از افت كيفيت اسپرم، جنس نر از تراف ها خارج گردد. معمولاً، اسپرم ها بعد از گذشت يك ساعت كيفيت خود را از دست مي دهند. بعد از اينكه صدف هاي ماده شروع به تخم ريزي كردند، از تراف هاي تخم ريزي به ظروف خاصِ انفرادي يا ليوان آزمايشگاهي به حجم يك ليتر انتقال داده مي شوند. اين ظروف حاوي 400 ميلي ليتر آب فيلتر شده ي دريا بوده و دمايي به ميزان 24-26 درجه سانتيگراد دارند. همين روند براي صدف هاي نر نيز بكار مي رود. بلافاصله بعد از ديدن خروج يك جريان مداوم و يكنواخت از سيفون خروجي، صدف از تراف هاي تخم ريزي خارج و وارد ظروف انفرادي مذكور مي گردند(تصوير -7). بر خلاف صدف هاي نر ، در جنس ماده تخم ها بصورت توده اي و متناوب از بدن خارج مي گردد.
زمان انجام عمل تخم ريزي متغير بوده ولي معمولاً 40-60 دقيقه به طول مي انجامد كه براي صدف هي ماده اين زمان كوتاهتر مي باشد. بعد از تخم ريزي، تخم ها به سرعت در كف ظروف ته نشين مي گردند. پس از پايان تخم ريزي، تخم ها بوسيله ي تور نايلوني با چشمه ي 60 ميكروني از ظروف خارج مي گردد. تخم ها به آرامي شستشو داده شده و به ظروف شيشه اي يا پلاستيكي حاوي آب صاف شده ي دريا با دماي 25 درجه سانتيگراد انتقال داده مي شوند. تخم ها، در ابتدا، گلابي شكل بوده ولي در مجاورت با آب دريا به سرعت به شكل كروي در مي آيد. تخم ها را مي توان در زير ميكروسكوپ با بزرگ نمايي 100 × مورد بررسي قرار داد. تخم هايي كه بعد از گذشت 10 دقيقه به حالت كروي در نيايند، براي عمل تكثير مناسب نيستند. اسپرم هاي مناسب براي انجام عمل لقاح تحرك بالايي از خود نشان مي دهند. به منظور حفظ تغيير پذيري در ذخاير ژنيِ نسل حاصله، از تخم هاي شش صدف ماده و اسپرم هاي همين تعداد صدف نر استفاده مي گردد.
لقاح
عمل لقاح با اضافه نمودن 2 ميلي ليتر سوسپانسيون اسپرم بر روي تخم ها انجام مي گيرد. اسپرم ها بايستي كمتر از 30 دقيقه و تخم ها كمتر از 60 دقيقه بعد از استحصال نگهداري شوند. بعد از اضافه نمودن اسپرم به تخم، محتويات ظروف به آرامي تكان داده شده و سپس به مدت 60-90 دقيقه به آنها اجازه داده مي شود تا در كف ظرف ته نشين گردند. در اين دوره ي زماني، تقسيمات سلولي تخم هاي لقاح يافته آغاز مي گردد. معمو لاً درصد لقاح در تخم هايي كه كاملاً رسيده باشند بيش از 90 درصد مي باشد.
رشد جنيني و لاروي
45 دقيقه بعد از لقاح، تقسيم سلولي آغاز مي گردد. تخم ها ابتدا به دوسلول برابر و سپس به چهار سلول نابرابر تقسيم مي شوند. در اين حالت يكي از سلول ها از سه سلول ديگر بزرگتر مي باشد. اولين نشانه ي يك لقاح موفق، خروج ساختار كوچك، شفاف و گنبدي شكل(اولين گويچه قطبي) از داخل تخم مي باشدسلول هاي كوچكتر به تقسيمات خود ادامه داده و توده ي سلولي به نام مورولا را بوجود مي آورند. در اين مرحله تخم ها سنگين شده و در كف ظروف ته نشين مي گردند. هر سلول حاوي مژه بوده كه بوسيله آن قادر به شنا مي باشند. جنين در اين مرحله به سمت نور جذب مي گردند.
پنج ساعت بعد از لقاح جنين وارد مرحله ي بلاستولا مي گردد. در اين مرحله بلاستوسل و بلاستوپور تشكيل شده و جنين به صورت توپي شكل با سلول هاي شفاف در مي آيند. هفت ساعت بعد از لقاح مرحله ي گاسترولا آغاز مي گردد. در اين مرحله جنين دو لايه شده و حفره ي گوارشي (archenteron) تشكيل مي شود. در مرحله ي گاسترولا يك تاژك در بخش قدامي و دسته اي مژك در بخش انتهايي بدن رشد مي يابد. در اين مرحله صدف ها را لارو هاي پشمالو يا تروكوفور مي نامند. اين لاروها نور گريز مي باشند بيست ساعت بعد از لقاح، لاروها نيمه شفاف بوده و حالت D شكل پيدا مي كند. صدف ها را در اين مرحله لاروهاي D شكل يا وليجر (veliger) مي نامند. در اين مرحله تاژك و مژك ها از بين رفته و بخشي به نام پرده يا velum به عنوان اندام حركتي ايجاد مي شود. لاروها در اين مرحله داراي دستگاه گوارش كامل و دو كفه مي باشند. پرده دايره اي بوده و مژه هاي روي آن سبب حركت لارو و جمع آوري فيتوپلانكتون هاي موجود در آب مي گردد( تصوير -10).طول لاروها در اين مرحله 80-100 ميكرون مي باشد. مرحله ي آمبو ( umbostage) مرحله ي بعدي مي باشد. در اين مرحله دو كفه بطور برابر رشد كرده و چين جبه تشكيل مي گردد. در سومين روز لارو بيضي شكل بوده و در هفته اول آمبو بطور واضح قابل ديد مي شود مرحله ي بعدي، مرحله ي صدفچه (spat) مي باشد. در اين مرحله اندام هاي لاروي (پرده يا velum ، پا و لكه ي چشمي )از بين مي رود. بعد از نشست صدفچه ها ساختار بالغ صدف شكل گرفته و پوسته ي جديد سريعاً توسط جبه ساخته مي شود.
منبع:
-
Spencer B.E., Molluscan Shellfish Farming.Fishing News Books,2002, PP: 45-77
-
FAO, Hatchaery Culture of Bivalves. A Practical Manual .www.fao.org.
-
FAO, Artifical propagation of bivalve: Techniques and methods.www.fao.org.
-
Thomas P.C.,Rath S.C., Mohapatra D.K., Breeding and seed production of Fin fish and Sellfish. Daya puplishing house.20
موسسه تحقیقات شیلات ایران
شیلات مازندران
شیلات استانها
موسسه تحقیقات بین المللی خاویاری شهید دادمان
سازمان خوار و بار و کشاورزی جهانی(فائو)
من و دنیا زیست ام
ویژه نامه تخصصی کروکودیل
ژینوس
رفقای شیلاتی
سایت تفریحی
فال آنلاین حافظ
عکس بازیگران
نرم افزار
سایت تخصصی موبایل
امکانات
